Определение меламина в продуктах питания

Определение меламина в продуктах питания

Смирнов Ю.Н., ЗАО "ЭПАК-Сервис"

Введение

Что такое меламин

Методы определения меламина

Введение

По сообщению Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей в Китайской Народной Республике зарегистрированы случаи отравления детей молочными смесями. Все дети потребляли детские молочные смеси китайского производства, содержащие меламин. Меламин был найден в различных видах детских молочных смесей, в замороженном йогурте и консервированном кофейном напитке. Все продукты были произведены, используя компоненты, сделанные из загрязненного меламином молока, с марта до 6 августа 2008 г. Меламин обнаружен в сыром молоке, произведенным Mengniu Dairy Group Co., Yili Industrial Co. и Shanghai-based Bright Dairy. 

Что такое меламин?

Меламин (2,4,6-триамино-1,3,5-триазин) используется для производства пластмасс, клея, лаков, ионообменных смол, дубителей, красителей и других видов химической продукции. Кроме того, меламин применяется при производстве ускорителей роста для растений. До 1978 года во многих странах мира меламин использовался как небелковый источник азота для домашнего скота, однако позже он был заменен на мочевину. Меламин - богатое азотом химическое вещество. Наравне с мочевиной используется недобросовестными производителями для создания иллюзии высокого содержания белка в молоке (при проведении большинства тестов содержание белка в молоке измеряется по содержанию азота). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), меламин является высокоопасным веществам второго класса опасности. Смертельная доза меламина при попадании в желудок 15—150 мг на килограмм живого веса. В литре молока Mengniu Dairy Group и Yili Industrial Group обнаружено 8,4 мг меламина.

При остром отравлении меламином наблюдается временный паралич конечностей, снижение рефлекторной возбудимости, усиленное потовыделение, кровотечение из носа. При малых дозах меламин провоцирует быстрый рост камней в почках, что и привело к гибели китайских младенцев. Образующиеся в почечных трубочках нерастворимые кристаллы ни что иное, как  продукты реакции конденсации меламина и его гомологов с целлюлозой и сахарами. Гомологи меламина (аммелин, аммелид и циануровая кислота) образуются в результате последовательного гидролиза меламина по аминогруппам и также представляют опасность.

В октябре 2008 г.  вступил в силу жесткий циркуляр  Роспотребнадзора: объявлены вне закона все китайские продукты, в составе которых есть молоко, а внедрение методики определения меламина в молочных продуктах признано приоритетным для проверяющих инстанций. Более того, весь продовольственный импорт из Китая выделен в «зону особого внимания».  Постановлением главного государственного санитарного врача РФ от 01.10.2008 № 56 внесены дополнения № 11 в СанПиН 2.3.2.1078–01 (СанПиН 2.3.2.2421-08) по допустимым уровням содержания меламина в молоке, молочных продуктах, детском питании, продуктах питания для беременных и кормящих женщин. Установлена норма 

Введенный запрет распространяется более чем на тысячу разных видов продуктов, в числе которых конфеты, печенье, йогурты и сухое молоко. В запретительных мерах Россия не одинока. Ранее аналогичные действия предпринял Евросоюз, который полностью отказался от импорта китайских детских молочных смесей. Кроме того, была введена многоступенчатая система проверки продуктов, импортируемых из Китая и содержащих более 15% молока. Аналогичным образом поступили и США, которые вдобавок начали отзывать из продажи быстрорастворимые чай и кофе с заменителями сливок. В связи с высокой актуальностью ВОЗ открыла специализированный сайт с информацией по данной теме.

Опасность попадания на российский рынок продуктов китайского производства содержащих меламин не стоит преуменьшать. Только за последние месяцы следы меламина в молочных  продуктах выявлены в Иркутске, Владивостоке, Кемерово, Томске, Хабаровске, Новосибирске и др.

 Методы определения меламина

В сложившейся ситуации фальсификации молока и молочных продуктов меламином необходимо предложить высокоселективный, чувствительный и точный метод определения меламина. Утвержденные Роспотребнадзором методические указания (МУК 4.1.2420-08) устанавливают в качестве основного метода определения меламина жидкостную хроматографию высокого разрешения, а в качестве арбитражного метода рекомендуют хромато-масс-спектрометрию.

А. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Хроматографические методы традиционно являются весьма эффективными для определения широкого круга органических примесей. Примеры применения метода ВЭЖХ для определения меламина в различных объектах  хорошо известны. МУК 4.1.2420-08 устанавливают метод ВЭЖХ для определения в пищевых продуктах массовых концентраций меламина в диапазоне 1,0-100 мг/кг. Методика основана на определении меламина в молоке и молочных продуктах методом обращеннофазной ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора или УФ-спектрофотометрического детектора с переменной длиной волны (длина волны 236 нм) после экстракции водным раствором трифторуксусной кислоты или смесью ацетонитрил-вода 50:50.     

Методика

Методика определения меламина включает несколько стадий: приготовление стандартных растворов меламина, пробоподготовка жидкого или твердого образца молокосодержащих продуктов, калибровка хроматографа и, собственно, сам анализ. Образцы анализируют методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с насосом высокого давления с подачей растворителя от 0,1 до 5,0 см³/мин., оборудованном системой для сбора и обработки хроматографических данных.

Условия обращено-фазовой ВЭЖХ (1-й способ)

Хроматографическая колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (ODS или C18), размер частиц 5 мкм, длина колонки 250 мм, внутренний диаметр колонки 4,6 мм или аналогичная. Подвижная фаза: ацетатный буфер, рН=5,5. Скорость подачи подвижной фазы: 1,0 см³/мин. Объем вводимой пробы 5-20 мкл. Коэффициент емкости меламина в этих условиях составляет величину порядка 2,5 (время удерживания от 6,5 до 7,0 минут, при времени выхода растворителя от 1,8 до 2,2 мин.). Приготовление подвижной фазы: 3,0 г ± 0,01 г уксуснокислого натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 дм3, добавляют дистиллированной воды до половины объема колбы, перемешивают до полного растворения соли, уксусной кислотой доводят рН до значения 5,5, и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через фильтровальную бумагу с диаметром пор 0,5 мкм.

Детектирование осуществляют при аналитической длине волны 236 нм (при использовании фотодиодноматричного детектора дополнительным подтверждением наличия меламина является совпадение УФ-спектра анализируемого вещества в диапазоне от 200 до 400 нм с УФ-спектром меламина).

Условия ион-парной ВЭЖХ (2-й способ)

Хроматографическая колонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (ODS или C18), размер частиц 5 мкм, длина колонки 250 мм, внутренний диаметр колонки 4,6 мм или аналогичная. Приготовление подвижной фазы: 10 ммоль (1,92 г) лимонной кислоты и 10 ммоль (1,66 г) гексансульфокислоты растворяют в 1 л дистиллированной воды и доводят 1 М раствором гидроксида натрия до рН=4,7. Состав подвижной фазы: ацетонитрил – буферный раствор  (1:9).

Скорость подачи подвижной фазы: 1,0 см³/мин. Объем вводимой пробы 5-20 мкл. Коэффициент емкости меламина в этих условиях составляет величину порядка 2,0 (время удерживания 6,0 минут, при времени выхода растворителя от 2,0).

Проведение испытаний с помощью метода ВЭЖХ

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляют путем сравнения со временем удерживания стандарта меламина и совпадения спектральных данных. Количественное определение ведут по заранее проведенной калибровке с использованием стандартных растворов меламина. Если пик меламина в исследуемом растворе выходит за пределы линейности, хроматографическое разделение проводят повторно после разбавления исследуемого раствора.

Предел обнаружения метода составляет 1,0 мг/кг при относительной погрешности 8-13% и степени извлечения меламина 78-92% в зависимости от исходной концентрации меламина в пробе.

Приборы

Для решения задачи определения меламина в продуктах питания и в соответствии с методическими указаниями по используемым приборам (МУК 4.1.2420-08)  компания «ЭПАК-Сервис» совместно с фирмой «PerkinElmer» предлагает готовую комплексную модульную систему для ВЭЖХ  HResLC Series 275:

Система HResLC Series 275 с UV/Vis детекторами включает:

• Новый сканирующий, программируемый, двулучевой  детектор с диодной матрицей Series 275 PDA.
• Новые колонки Brownlee™ HRes LC для бескомпромиссного разделения.
• Новая бинарная система насосов Series 275 для работы под давлением до 10000 psig.
• Новый специализированный автодозатор Series 275 обеспечивает “аналитические” характеристики при высоком давлении.

Методика определения меламина, основанная на системе HResLC Series 275, доработана и выгодно отличается по ряду важнейших параметров от  предлагаемой методики МУК 4.1.2420-08. В частности, предел обнаружения снижен  до  уровня 0,1 мг/кг, диапазон измеряемых концентраций меламина расширен  от 0,1 до 2000 мг/кг, при этом точность анализа не ухудшается.  Важно отметить, что система HResLC Series 275 может работать как в режиме быстрой хроматографии высокого разрешения (HRes), так и в традиционной высокоэффектовной жидкостной хроматографии (HPLC).

Б. Хромато-масс-спектрометрия

С проблемой определения меламина управление по контролю за продуктами и лекарствами (департамент здоровья США) столкнулись еще в 2006 году, когда США отказались ввозить китайское питание для домашних животных, в котором также содержался меламин. В мае 2007 г. в  США были опубликованы соответствующие меморандум и  рекомендации по анализу меламина и его гомологов  в пище.  Однако предложенные методики могут быть использованы лишь для качественного и полуколичественного анализа. Поэтому в дальнейшем компанией «PerkinElmer» был разработан специальный анализатор меламина EcoAnalytix™ Melamine Analyzer.       

Анализатор включает в себя:

• Хромато-масс-спектрометр Clarus® 600MS.
• Пакет программного обеспечения (CD) содержит подробное руководство пользователя, обучающую программу, составленную профессионалами и более 50 предустановленных  типичных методик анализа. Кроме этого имеется обширная библиотека стандартных спектров меламина и его гомологов. Эти спектры получены на хромато-масс-спектрометре Clarus® 600MS впервые и ранее не публиковались.
• Все расходные материалы необходимые для анализа, включая стандартные вещества меламина и его гомологов.  

Данный анализатор не имеет аналогов в мире и позволяет поставить надежную, высокочувствительную методику количественного определения меламина и всех  его гомологов в продуктах питания.

Методика

Методика, предлагаемая компанией PerkinElmer, включает 2 стадии пробоподготовки: экстракция меламина и его дериватизация (перевод меламина в другое химическое соединение с помощью триметилсилила (ТМС) для улучшения его аналитических свойств), завершающая стадия количественного определения основана на хромато-масс-спектрометрии.

Если образец сухой (например, сухое молоко), на первом этапе проводят экстракцию меламина. Взвешивают 0.5 г образца, помещают в колбу с 20 мл раствора диэтиламин-вода-ацетонитрил в соотношении 10:40:50 (по объему). Для полноты экстракции раствор озвучивают в ультразвуковой бане в течение 30 мин при комнатной температуре.   Затем отфильтровывают раствор  на тефлоновом фильтре (0.45 мкм).  Тефлоновый фильтр рекомендуют использовать из-за большого количества химических соединений в пище, способных сорбироваться на фильтрах другого состава. Из фильтрата берут аликвоту 200 мкл и выпаривают досуха при температуре 70^оС в токе чистого сухого азота.

На втором этапе пробоподготовки (дериватизации) очищенный и сухой продукт помещают в емкость автоматического пробоотборника вместе с 200 мкл пиридина и 100 мкл внутреннего стандарта (раствор 2,6-диамино-4-хлоропиридин в пиридине с концентрацией 0.5 мкг/мл, иногда стандартный раствор заменяют чистым пиридином). Затем добавляют 200мкл специального реагента Sylon-BFT, содержащего ТМС, для завершения его реакции с меламином и гомологами достаточно выдержать раствор при 70^оС в течение 45 мин. На данном этапе важно учитывать природу объекта (его матрицу).  В зависимости от того богата матрица аминокислотами или нет, потребуется различное количество реагента Sylon-BFT (такое количество необходимо установить в предварительных экспериментах). Внутренний стандарт 2,6-диамино-4-хлоропиридин (DACP) используется для мониторинга процесса дериватизации, например, маленький пик DACP на хроматограмме говорит о не полной дериватизации, что может быть вызвано, например, остаточной водой в матрице. В некоторых случаях внутренний стандарт не применяется и может быть заменен чистым пиридином.

Завершающим этапом является получение хромато-масс-спектров ТМС-производных меламина. Ниже представлены некоторые оптимизированные параметры проведения анализа на приборе Clarus® 600MS для случая определения меламина в рисе. На этапе хроматографического разделения использовались: хроматографическая колонка - Elite -5MS (30m x 0.25mm x 0.25μm); газ-носитель – He (1мл/мин); вводимый объем – 0,5 мкл (увеличение объема может привести к ухудшению четкости хроматографических пиков); температура ввода – 280^оС. Однако в зависимости от конкретного объекта (состава матрицы) может потребоваться некоторая модификация хроматографического этапа. В частности, если расположение пиков аналита и матричных пиков близки (по времени удерживания), то может потребоваться перепрограммирование температурного  режима колонки, а также изменение времени разделения. Во избежание дополнительных затруднений не следует забывать и о контроле за  чистотой всех используемых растворителей и реагентов.

Масс-спектрометрическое детектирование проводили, сканируя спектр в диапазоне  50-450 m/z. Аналиты  идентифицировали по  соответствующим спектрам индивидуальным веществ, заложенных  в базе спектров. Температура ионизации составляла 230^оС.

Как упоминалось выше, обнаружение меламина или его гомологов указывает на фальсификацию, делающую продукт незаконным в области производства пищи или пищевых добавок. Из-за угрозы для здоровья людей и животных, а также из-за финансового риска для ряда компаний любые анализы по определению меламина должны быть чрезвычайно достоверными с научной точки зрения. К тому же метод должен быть весьма чувствительным и по возможности определять меламин в широком диапазоне концентраций. Метод, предлагаемый компанией PerkinElmer, хорошо удовлетворяет эти требованиям.  

Рис.1. Хроматограмма стандартного раствора ТМС-производных меламина (0.1 мкг/мл).     

На рис.1 представлена  хроматограмма стандартного раствора меламина с низкой  концентрацией. На хроматограмме видны четкие пики, соответствующие меламину и его гомологам. Это позволяет надежно идентифицировать меламин и его гомологи в реальных объектах на уровне десятых долей ppm.

Как видно из хроматограммы реального объекта (рис.2) большие пики хорошо совпадают с пиками меламина и его 3  гомологов, что доказывает присутствие меламина, т.е. фальсификацию  данного пищевого продукта. По наличию  пика DCAP можно сделать вывод о полноте дериватизации, в нашем случае средние площади пика DCAP на хроматограммах реального объекта и стандарта составил 646,585 ед. и 643,161 ед., соответственно, что указывает на полноту дериватизации в обоих случаях.

Рис.2. Хроматограмма реального объекта (рисовый порошок)        

Уровень загрязнения рисового порошка меламином в нашем случае оказался таким большим, что хроматографическая колонка испытала перегрузку и на  хроматограмме можно заметить некоторое смещение и искажение пиков циануровой кислоты и аммелида (по сравнению со стандартом). Т.к. в данном случае величина соответствующих пиков аналита значительно превышают стандарт, можно порекомендовать провести повторный анализ с меньшим количеством исходного образца. 

В любом случае после небольшой модификации представленная здесь хроматографическая методика идентификации позволяет надежно отделить  все пики аналита от матричных пиков. Кроме того, для решения важной проблемы определения следовых количеств меламина в предлагаемом методе хромато-масс-спектрометрии используется система SIFI™ (сочетание сканирования отдельных ионов и полного сканирование спектра), которая позволяет максимально увеличить чувствительность метода и  более полно описать характеристики образца.

На рис.3 представлены хромато-масс-спектры стандартного раствора меламином (его ТМС-формой) и реального объекта. Совпадение данных по времени удерживания и спектральных данных в обоих спектрах подтверждает правильность идентификации меламина.  

Рис.3. Сопоставление масс-спектральных данных по меламину для стандартного образца и реального объекта. 

Во всем мире для производства пищевых продуктов используется огромное число протеиносодержащих  веществ. Недавние случаи фальсификации с меланином вынуждают нас использовать более тщательные методы анализа пищи и пищевых добавок. Требуются методы, которые позволяют определять мельчайшие примеси всех азотосодержащих веществ и которые могут подтвердить подлинность протеина в продуктах. Именно такой метод для рутинного анализа на основе прибора Clarus® 600MS предлагает компания «ЭПАК-Сервис» совместно с фирмой «PerkinElmer».